Nestekromatografia on pääasiallinen menetelmä raaka-aineissa, välituotteissa, valmisteissa ja pakkausmateriaaleissa olevien ainesosien ja epäpuhtauksien testaamiseen, mutta monilla aineilla ei ole vakiomenetelmiä, joihin luottaa, joten uusien menetelmien kehittäminen on väistämätöntä. Nestefaasimenetelmien kehittämisessä kromatografinen kolonni on nestekromatografian ydin, joten sopivan kromatografisen kolonnin valinta on ratkaisevaa. Tässä artikkelissa kirjoittaja selittää, kuinka nestekromatografiakolonni valitaan kolmesta näkökulmasta: yleisideat, näkökohdat ja sovellusalue.
A. Yleisiä ideoita nestekromatografiakolonnien valintaan
1. Arvioi analyytin fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet: kuten kemiallinen rakenne, liukoisuus, stabiilisuus (kuten onko se helppo hapettaa/pelkistää/hydrolysoitua), happamuus ja emäksisyys jne., erityisesti kemiallinen rakenne on avainasemassa tekijä ominaisuuksien määrittämisessä, kuten konjugoidulla ryhmällä on voimakas ultraviolettiabsorptio ja voimakas fluoresenssi;
2. Määritä analyysin tarkoitus: vaaditaanko korkea erotus, korkea kolonnin tehokkuus, lyhyt analyysiaika, korkea herkkyys, korkea paineenkestävyys, pitkä kolonnin käyttöikä, alhainen hinta jne.;
- Valitse sopiva kromatografinen kolonni: ymmärrä kromatografisen täyteaineen koostumus, fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet, kuten hiukkaskoko, huokoskoko, lämpötilansieto, pH-sieto, analyytin adsorptio jne.
- Nestekromatografiakolonnien valinnassa huomioitavaa
Tässä luvussa käsitellään tekijöitä, jotka on otettava huomioon valittaessa kromatografiakolonnia itse kromatografiakolonnin fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien näkökulmasta. 2.1 Täytematriisi
2.1.1 Silikageelimatriisi Useimpien nestekromatografiakolonnien täytematriisi on silikageeli. Tämän tyyppisellä täyteaineella on korkea puhtaus, alhainen hinta, korkea mekaaninen lujuus ja se on helppo muokata ryhmiä (kuten fenyylisidos, aminosidos, syaanisidos jne.), mutta sen sietämä pH-arvo ja lämpötila-alue ovat rajalliset: Useimpien silikageelimatriisitäyteaineiden pH-alue on 2 - 8, mutta erityisesti modifioitujen silikageelillä sidottujen faasien pH-alue voi olla jopa 1,5 - 10, ja on myös erityisesti modifioituja silikageelillä sitoutuneita faaseja, jotka ovat stabiileja alhaisessa pH:ssa, kuten Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, joka on stabiili pH-arvossa 1-8; silikageelimatriisin lämpötilan yläraja on yleensä 60 ℃, ja jotkin kromatografiakolonnit kestävät 40 ℃ lämpötilan korkeassa pH:ssa.
2.1.2 Polymeerimatriisi Polymeeritäyteaineet ovat enimmäkseen polystyreeni-divinyylibentseeniä tai polymetakrylaattia. Niiden etuna on, että ne kestävät laajaa pH-aluetta – niitä voidaan käyttää välillä 1-14, ja ne kestävät paremmin korkeita lämpötiloja (voivat nousta yli 80 °C:een). Verrattuna piidioksidipohjaisiin C18-täyteaineisiin tämäntyyppisillä täyteaineilla on vahvempi hydrofobisuus, ja makrohuokoinen polymeeri on erittäin tehokas näytteiden, kuten proteiinien, erottamisessa. Sen haittapuolena on, että kolonnin hyötysuhde on pienempi ja mekaaninen lujuus heikompi kuin piidioksidipohjaisilla täyteaineilla. 2.2 Hiukkasten muoto
Useimmat nykyaikaiset HPLC-täyteaineet ovat pallomaisia hiukkasia, mutta joskus ne ovat epäsäännöllisiä hiukkasia. Pallomaiset hiukkaset voivat tarjota alhaisemman kolonnin paineen, korkeamman kolonnin tehokkuuden, vakauden ja pidemmän käyttöiän; käytettäessä korkean viskositeetin liikkuvia faaseja (kuten fosforihappoa) tai kun näyteliuos on viskoosi, epäsäännöllisillä hiukkasilla on suurempi ominaispinta-ala, mikä edistää kahden faasin täydellistä toimintaa ja hinta on suhteellisen alhainen. 2.3 Partikkelikoko
Mitä pienempi hiukkaskoko, sitä suurempi kolonnin hyötysuhde ja suurempi erotus, mutta sitä huonompi korkean paineen kestävyys. Yleisimmin käytetty kolonni on 5 μm:n hiukkaskoon kolonni; jos erotusvaatimus on korkea, voidaan valita 1,5-3 μm täyteaine, joka auttaa ratkaisemaan joidenkin monimutkaisten matriisi- ja monikomponenttinäytteiden erotusongelman. UPLC voi käyttää 1,5 μm täyteaineita; Puolipreparatiivisissa tai preparatiivisissa kolonneissa käytetään usein 10 μm:n tai suurempia hiukkaskokoja täyteaineita. 2.4 Hiilipitoisuus
Hiilipitoisuus viittaa sitoutuneen faasin osuuteen silikageelin pinnalla, joka liittyy ominaispinta-alaan ja sitoutuneen faasin peittoon. Korkea hiilipitoisuus tarjoaa suuren kolonnikapasiteetin ja korkean resoluution, ja sitä käytetään usein monimutkaisissa näytteissä, jotka vaativat suurta erotusta, mutta kahden faasin välisen pitkän vuorovaikutusajan vuoksi analyysiaika on pitkä; matalahiilipitoisilla kromatografiapylväillä on lyhyempi analyysiaika ja niillä voi olla erilaisia selektiivisyyksiä, ja niitä käytetään usein yksinkertaisiin näytteisiin, jotka vaativat nopeaa analyysiä, ja näytteissä, jotka vaativat korkean vesifaasin olosuhteita. Yleensä C18:n hiilipitoisuus vaihtelee välillä 7 % - 19 %. 2.5 Huokoskoko ja ominaispinta-ala
HPLC-adsorptioväliaineet ovat huokoisia hiukkasia, ja suurin osa vuorovaikutuksista tapahtuu huokosissa. Siksi molekyylien on päästävä huokosiin adsorboituakseen ja erotettavaksi.
Huokoskoko ja ominaispinta-ala ovat kaksi toisiaan täydentävää käsitettä. Pieni huokoskoko tarkoittaa suurta ominaispinta-alaa ja päinvastoin. Suuri ominaispinta-ala voi lisätä näytemolekyylien ja sitoutuneiden faasien välistä vuorovaikutusta, parantaa retentiota, lisätä näytteen kuormitusta ja kolonnin kapasiteettia sekä monimutkaisten komponenttien erottamista. Täyshuokoiset täyteaineet kuuluvat tämän tyyppisiin täyteaineisiin. Niille, joilla on korkeat erotusvaatimukset, on suositeltavaa valita täyteaineita, joilla on suuri ominaispinta-ala; Pieni ominaispinta-ala voi vähentää vastapainetta, parantaa kolonnin tehokkuutta ja lyhentää tasapainoaikaa, mikä sopii gradienttianalyysiin. Ydinkuoritäyteaineet kuuluvat tämän tyyppisiin täyteaineisiin. Erottamisen takaamiseksi on suositeltavaa valita pienellä ominaispinta-alalla täyteaineita niille, joilla on korkeat analyysitehokkuusvaatimukset. 2.6 Huokostilavuus ja mekaaninen lujuus
Huokostilavuus, joka tunnetaan myös nimellä "huokostilavuus", viittaa huokostilavuuden kokoon hiukkasyksikköä kohti. Se voi hyvin heijastaa täyteaineen mekaanista lujuutta. Suuren huokostilavuuden omaavien täyteaineiden mekaaninen lujuus on hieman heikompi kuin pienihuokosisten täyteaineiden. Täyteaineita, joiden huokostilavuus on pienempi tai yhtä suuri kuin 1,5 ml/g, käytetään useimmiten HPLC-erotukseen, kun taas täyteaineita, joiden huokostilavuus on suurempi kuin 1,5 ml/g, käytetään pääasiassa molekyyliekskluusiokromatografiaan ja matalapainekromatografiaan. 2.7 Rajausaste
Päätös voi vähentää yhdisteiden ja paljaiden silanoliryhmien välisen vuorovaikutuksen aiheuttamia pyrstöhuippuja (kuten alkalisten yhdisteiden ja silanoliryhmien välisiä ionisidoksia, van der Waalsin voimia ja vetysidoksia happamien yhdisteiden ja silanoliryhmien välillä), mikä parantaa kolonnin tehokkuutta ja piikkien muotoa. . Päällystämättömät sidotut faasit tuottavat erilaisia selektiivisyyksiä suhteessa katettuihin sitoutuneisiin faaseihin, erityisesti polaarisille näytteille.
- Erilaisten nestekromatografiakolonnien käyttöalue
Tässä luvussa kuvataan erityyppisten nestekromatografiakolonnien käyttöalueita joissakin tapauksissa.
3.1 Käänteisen faasin C18-kromatografinen pylväs
C18-kolonni on yleisimmin käytetty käänteisfaasikolonni, joka täyttää useimpien orgaanisten aineiden pitoisuus- ja epäpuhtaustestit ja soveltuu keskipolaarisille, heikosti polaarisille ja ei-polaarisille aineille. C18-kromatografisen kolonnin tyyppi ja erittely tulee valita erityisten erotusvaatimusten mukaan. Esimerkiksi aineille, joilla on korkeat erotusvaatimukset, käytetään usein 5 μm * 4,6 mm * 250 mm määrityksiä; Aineille, joilla on monimutkainen erotusmatriisi ja samanlainen polariteetti, voidaan käyttää 4 μm*4,6 mm*250 mm spesifikaatioita tai pienempiä hiukkaskokoja. Kirjoittaja esimerkiksi käytti 3 μm * 4,6 mm * 250 mm kolonnia kahden genotoksisen epäpuhtauden havaitsemiseksi selekoksibi API:ssa. Näiden kahden aineen erotus voi olla 2,9, mikä on erinomaista. Lisäksi erotuksen varmistamisen edellytyksenä, jos nopeaa analyysiä tarvitaan, valitaan usein lyhyt 10 mm tai 15 mm kolonni. Esimerkiksi kun kirjoittaja käytti LC-MS/MS-menetelmää genotoksisen epäpuhtauden havaitsemiseen piperakiinifosfaatti API:ssa, käytettiin 3 μm * 2,1 mm * 100 mm kolonnia. Epäpuhtauden ja pääkomponentin välinen erotus oli 2,0 ja näytteen havaitseminen voidaan suorittaa 5 minuutissa. 3.2 Käänteisfaasifenyylipylväs
Fenyylikolonni on myös eräänlainen käänteisfaasikolonni. Tämän tyyppisellä kolonnilla on vahva selektiivisyys aromaattisten yhdisteiden suhteen. Jos aromaattisten yhdisteiden vaste tavallisella C18-kolonnilla mitattuna on heikko, voit harkita fenyylikolonnin vaihtamista. Esimerkiksi kun tein selekoksibi API:ta, pääkomponentin vaste mitattuna saman valmistajan fenyylikolonnissa ja samalla spesifikaatiolla (kaikki 5 μm * 4,6 mm * 250 mm) oli noin 7 kertaa suurempi kuin C18-kolonnissa. 3.3 Normaalivaiheinen kolonni
Normaalifaasikolonni soveltuu tehokkaaksi täydennykseksi käänteisfaasikolonniin erittäin polaarisille yhdisteille. Jos piikki on edelleen erittäin nopea eluoitaessa yli 90-prosenttisella vesifaasilla käänteisfaasikolonnissa ja jopa lähellä liuotinhuippua ja menee päällekkäin sen kanssa, voit harkita normaalifaasikolonnin vaihtamista. Tämäntyyppinen kolonni sisältää hilic-kolonni, aminokolonni, syaanikolonni jne.
3.3.1 Hilic-kolonni Hilic-kolonni sisältää yleensä hydrofiilisiä ryhmiä sitoutuneeseen alkyyliketjuun tehostaakseen vastetta polaarisille aineille. Tämäntyyppinen kolonni soveltuu sokeriaineiden analysointiin. Kirjoittaja käytti tämäntyyppistä saraketta tehdessään ksyloosin ja sen johdannaisten sisältöä ja siihen liittyviä aineita. Ksyloosijohdannaisen isomeerit voidaan myös erottaa hyvin;
3.3.2 Aminokolonni ja syaanikolonni Aminokolonni ja syaanikolonni viittaavat amino- ja syaanimuunnelmien lisäämiseen sitoutuneen alkyyliketjun loppuun, mikä parantaa selektiivisyyttä erikoisaineille: esimerkiksi aminokolonni on hyvä valinta sokereiden, aminohappojen, emästen ja amidien erottamiseen; syanokolonnissa on parempi selektiivisyys erotettaessa hydrattuja ja hydraamattomia rakenteellisia samanlaisia aineita konjugoitujen sidosten läsnäolon vuoksi. Aminokolonnia ja syaanikolonnia voidaan usein vaihtaa normaalivaihekolonnin ja käänteisfaasikolonnin välillä, mutta toistuvaa vaihtoa ei suositella. 3.4 Kiraalinen kolonni
Kiraalinen kolonni soveltuu nimensä mukaisesti kiraalisten yhdisteiden erottamiseen ja analysointiin erityisesti lääkealalla. Tämän tyyppistä kolonnia voidaan harkita, kun tavanomaiset käänteisfaasi- ja normaalifaasikolonnit eivät pysty erottelemaan isomeerejä. Esimerkiksi kirjoittaja käytti 5 μm * 4,6 mm * 250 mm kiraalista kolonnia erottamaan 1,2-difenyylietyleenidiamiinin kaksi isomeeriä: (1S, 2S)-1, 2-difenyylietyleenidiamiini ja (1R, 2R)-1, 2 -difenyylietyleenidiamiini, ja näiden kahden välinen erotus saavutti noin 2,0. Kiraaliset kolonnit ovat kuitenkin kalliimpia kuin muun tyyppiset kolonnit, yleensä 1W+/kpl. Jos tällaisia sarakkeita tarvitaan, yksikön on tehtävä riittävä budjetti. 3.5 Ioninvaihtokolonni
Ioninvaihtokolonnit soveltuvat varautuneiden ionien, kuten ionien, proteiinien, nukleiinihappojen ja joidenkin sokeriaineiden, erottamiseen ja analysointiin. Täyteainetyypin mukaan ne jaetaan kationinvaihtokolonniin, anioninvaihtokolonniin ja vahvoihin kationinvaihtokolonniin.
Kationinvaihtokolonneja ovat kalsium- ja vetypohjaiset kolonnit, jotka soveltuvat pääasiassa kationisten aineiden, kuten aminohappojen, analysointiin. Esimerkiksi kirjoittaja käytti kalsiumpohjaisia pylväitä analysoidessaan kalsiumglukonaattia ja kalsiumasetaattia huuhteluliuoksessa. Molemmilla aineilla oli voimakas vaste λ = 210 nm:ssä ja erotusaste saavutti 3,0; kirjoittaja käytti vetypohjaisia pylväitä analysoidessaan glukoosiin liittyviä aineita. Useilla tärkeimmillä sukulaisaineilla – maltoosilla, maltotrioosilla ja fruktoosilla – oli korkea herkkyys differentiaalitunnistimissa, havaitsemisraja oli niinkin alhainen kuin 0,5 ppm ja erotusaste 2,0-2,5.
Anioninvaihtokolonnit soveltuvat pääasiassa anionisten aineiden, kuten orgaanisten happojen ja halogeeni-ionien, analysointiin; vahvoilla kationinvaihtopylväillä on suurempi ioninvaihtokapasiteetti ja selektiivisyys, ja ne soveltuvat monimutkaisten näytteiden erottamiseen ja analysointiin.
Yllä oleva on vain johdatus useiden yleisten nestekromatografiakolonnien tyyppeihin ja käyttöalueisiin yhdistettynä tekijän omaan kokemukseen. Varsinaisissa sovelluksissa on myös muita erityistyyppejä kromatografiapylvääjä, kuten suurihuokoiset kromatografiakolonnit, pienihuokoiset kromatografiakolonnit, affiniteettikromatografiakolonnit, monimuotokromatografiakolonnit, ultrakorkean suorituskyvyn nestekromatografiakolonnit (UHPLC), superkriittiset nestekromatografiakolonnit ( SFC) jne. Niillä on tärkeä rooli eri aloilla. Erityinen kromatografiakolonnin tyyppi on valittava näytteen rakenteen ja ominaisuuksien, erotusvaatimusten ja muiden tarkoitusten mukaan.
Postitusaika: 14.6.2024