Nestekromatografian kvantitatiivisen analyysin periaatteet ja menetelmät

Nestekromatografian erotusmekanismi perustuu eroon seoksen komponenttien affiniteetissa näitä kahta faasia kohtaan.

Eri stationäärifaasien mukaan nestekromatografia jaetaan neste-kiintoainekromatografiaan, neste-nestekromatografiaan ja sidottufaasikromatografiaan.Laajimmin käytettyjä ovat neste-kiintoainekromatografia silikageelillä täyteaineena ja sidottufaasikromatografia mikrosilikalla matriisina.

Stationaarifaasin muodon mukaan nestekromatografia voidaan jakaa pylväskromatografiaan, paperikromatografiaan ja ohutkerroskromatografiaan.Adsorptiokapasiteetin mukaan se voidaan jakaa adsorptiokromatografiaan, partitiokromatografiaan, ioninvaihtokromatografiaan ja geelipermeaatiokromatografiaan.

Viime vuosina nestepylväskromatografiajärjestelmään on lisätty korkeapaineinen nestevirtausjärjestelmä, jotta liikkuva faasi virtaa nopeasti korkeassa paineessa erotusvaikutuksen parantamiseksi, joten tehokas (tunnetaan myös nimellä korkeapaine) nestekromatografia on ilmaantunut.

OSA
01 Nestekromatografian kvantitatiivisen analyysin periaate

Kvaliteetin perusteella kvantifiointi edellyttää puhtaita aineita standardeina.

Nestekromatografinen kvantitointi on suhteellisen kvantitatiivinen menetelmä: eli seoksessa olevan analyytin määrä arvioidaan tunnetusta määrästä puhdasta standardinäytettä

OSA
02 Nestekromatografian kvantifioinnin perusteet

Mitatun komponentin määrä (W) on verrannollinen vastearvoon (A) (piikin korkeus tai piikin pinta-ala), W=f×A.

Kvantitatiivinen korjauskerroin (f): Se on kvantitatiivisen laskentakaavan suhteellisuusvakio, ja sen fyysinen merkitys on yksikkövastearvon (huippualueen) edustaman mitatun komponentin määrä.

Kvantitatiivinen korjauskerroin saadaan tunnetusta standardinäytteen määrästä ja sen vastearvosta.

Mittaa tuntemattoman komponentin vastearvo, niin komponentin määrä saadaan kvantitatiivisella korjauskertoimella.

OSA
03 Yleiset termit kvantitatiivisessa analyysissä

Näyte (näyte): liuos, joka sisältää analyytin kromatografista analyysiä varten.Jaettu vakio- ja tuntemattomiin näytteisiin.

Vakio: Puhdas tuote, jonka pitoisuus tunnetaan.Tuntematon näyte (tuntematon): Seos, jonka pitoisuus on testattava.

Näytteen paino: Testattavan näytteen alkuperäinen punnitus.

Laimennus: Tuntemattoman näytteen laimennuskerroin.

Komponentti: kvantitatiivisesti analysoitava kromatografinen piikki, eli analyytti, jonka sisältöä ei tunneta.

Komponentin määrä (määrä): testattavan aineen pitoisuus (tai pitoisuus).

Integerity: Laskennallinen prosessi kromatografisen huipun huippualueen mittaamiseksi tietokoneella.

Kalibrointikäyrä: Lineaarinen käyrä komponenttien sisällöstä vastearvoon, joka on muodostettu tunnetusta standardiainemäärästä ja jota käytetään määrittämään analyytin tuntematon pitoisuus.

OSA
04 Nestekromatografian kvantitatiivinen analyysi

1. Valitse kvantitatiiviseen analyysiin sopiva kromatografinen menetelmä:

l Vahvista havaitun komponentin huippu ja saavuta resoluutio (R), joka on suurempi kuin 1,5

l Määritä testattujen komponenttien kromatografisten piikkien sakeus (puhtaus).

l Määritä menetelmän havaitsemisraja ja kvantifiointiraja;herkkyys ja lineaarinen alue

2. Määritä kalibrointikäyrä eri pitoisuuksilla olevista standardinäytteistä

3. Tarkista kvantitatiivisten menetelmien tarkkuus ja tarkkuus

4. Käytä vastaavaa kromatografian hallintaohjelmistoa näytteiden keräämiseen, tietojenkäsittelyyn ja tulosten raportointiin

OSA
05 Kvantitatiivisten piikkien tunnistaminen (laadullinen)

Tunnista kvalitatiivisesti jokainen kvantifioitava kromatografinen piikki

Käytä ensin standardinäytettä kvantitatiivisesti määritettävän kromatografisen piikin retentioajan (Rt) määrittämiseen.Vertailemalla retentioaikaa etsi komponentti, joka vastaa tuntemattoman näytteen kutakin kromatografista huippua.Kromatografinen kvalitatiivinen menetelmä on verrata retentioaikaa standardinäytteeseen.Kriteeri Riittämätönlisävahvistus (laadullinen)

1. Vakiolisäysmenetelmä

2. Käytä muita menetelmiä samaan aikaan: muita kromatografisia menetelmiä (muuta mekanismia, kuten: eri kromatografiakolonnien käyttö), muita ilmaisimia (PDA: spektrien vertailu, spektrikirjastohaku; MS: massaspektrianalyysi, spektrikirjastohaku)

3. Muut välineet ja menetelmät

OSA
06 Kvantitatiivisen huipun johdonmukaisuuden vahvistus

Varmista kromatografisen piikin konsistenssi (puhtaus)

Varmista, että kunkin kromatografisen piikin alla on vain yksi mitattu komponentti

Tarkista yhteiseluoituvien aineiden (epäpuhtauksien) aiheuttamat häiriöt

Menetelmät kromatografisen piikin konsistenssin (puhtaus) vahvistamiseksi

Spektrogrammien vertaaminen valodiodimatriisitunnistimiin (PDA).

Huippupuhtaustunnistus

2996 Puhtauskulmateoria

OSASSA 07 yleisesti käytetyt kvantitatiiviset menetelmät

Vakiokäyrämenetelmä, joka on jaettu ulkoiseen standardimenetelmään ja sisäiseen standardimenetelmään:

1. Ulkoinen standardimenetelmä: eniten käytetty nestekromatografiassa

Valmistettiin sarja tunnettujen pitoisuuksien standardinäytteitä käyttämällä standardinäytteinä testattavien yhdisteiden puhtaita näytteitä.ruiskutetaan kolonniin vastearvoon (huippualueen) asti.
Tietyllä alueella standardinäytteen pitoisuuden ja vastearvon välillä on hyvä lineaarinen suhde, nimittäin W= f×A , ja standardikäyrä tehdään.

Injektoi tuntematon näyte täsmälleen samoissa koeolosuhteissa saadaksesi mitattavan komponentin vastearvon.Tunnetun kertoimen f mukaan voidaan saada mitattavan komponentin pitoisuus.

Ulkoisen standardimenetelmän edut:yksinkertainen toiminta ja laskenta, se on yleisesti käytetty kvantitatiivinen menetelmä;jokaista komponenttia ei tarvitse havaita ja eluoida;vakionäyte vaaditaan;standardinäytteen ja tuntemattoman näytteen mittausolosuhteiden on oltava yhdenmukaiset;injektiomäärän tulee olla tarkka.

Ulkoisen standardimenetelmän haitat:Koeolosuhteiden on oltava korkeita, kuten ilmaisimen herkkyyttä, virtausnopeutta ja liikkuvan faasin koostumusta ei voida muuttaa;kunkin injektion tilavuuden tulee olla hyvä toistettavuus.

2. Sisäinen standardimenetelmä: tarkka, mutta hankala, useimmiten käytetty standardimenetelmissä

Tunnettu määrä sisäistä standardia lisätään standardiin sekastandardin valmistamiseksi, ja valmistetaan sarja tunnetun pitoisuuden omaavia työstandardeja.Standardin ja sisäisen standardin moolisuhde sekastandardissa pysyy muuttumattomana.Injektoi kromatografiseen kolonniin ja ota vastearvoksi (standardinäytteen piikin pinta-ala/sisäinen standardinäytteen piikin pinta-ala).Vastearvon ja työstandardin pitoisuuden välisen lineaarisen suhteen mukaan, nimittäin W= f×A, tehdään standardikäyrä.

Tunnettu määrä sisäistä standardia lisätään tuntemattomaan näytteeseen ja injektoidaan kolonniin mitattavan komponentin vastearvon saamiseksi.Tunnetun kertoimen f mukaan voidaan saada mitattavan komponentin pitoisuus.

Sisäisen standardin menetelmän ominaisuudet:Toimenpiteen aikana näyte ja sisäinen standardi sekoitetaan keskenään ja injektoidaan kromatografiseen kolonniin niin kauan kuin mitatun komponentin määrän suhde sisäiseen standardiin sekoitetussa liuoksessa on vakio, näytetilavuuden muutos ei vaikuta kvantitatiivisiin tuloksiin..Sisäinen standardimenetelmä korvaa näytetilavuuden ja jopa liikkuvan vaiheen ja ilmaisimen vaikutuksen, joten se on tarkempi kuin ulkoinen standardimenetelmä.

OSA
08 Kvantitatiivisen analyysin tuloksiin vaikuttavat tekijät

Huono tarkkuus voi johtua seuraavista syistä:

Virheellinen piikkialueen integraatio, näytteen hajoaminen tai näytteen valmistuksen aikana syntyneet epäpuhtaudet, näytepullo ei ole suljettu, näytteen tai liuottimen haihtuminen, väärä näytteen valmistelu, näytteen injektio-ongelmat, väärä sisäisen standardin valmistelu

Mahdollisia syitä huonoon tarkkuuteen:

Virheellinen piikin integrointi, injektio- tai injektoriongelmat, näytteen hajoaminen tai näytteen valmistuksen aikana syntyneet epäpuhtaudet, kromatografiset ongelmat, huonontunut ilmaisinvaste